2.2.特異性產甲烷活性測試

2.2.1.乙酸特異性產甲烷活性

用于批次測定的接種物是第134天從兩個消化器取出的流出物。將10 ml接種物添加到120 ml血清瓶中的無菌培養基（最終體積100 ml）中。血清瓶用氮氣沖洗2分鐘以提供厭氧條件。然后用丁基橡膠塞密封。無菌培養基由基本厭氧培養基和乙酸鈉（初始濃度2、4、6、8、15 g-COD/L）組成。為了模擬對照和剝離消化器中類似的conditions，無菌培養基的總銨態氮濃度通過氯化銨調節至6.8和5.8 g-N/L，pH通過氫氧化鈉調節至7.8。每個消化器總共設置12個血清瓶，包括兩個沒有乙酸設置的平行瓶作為對照。將瓶子在37°C培養直至沼氣生產停止。乙酸特異性產甲烷活性基于方程（1）計算。

特異性產甲烷活性（乙酸）=(1/(揮發性懸浮固體·反應器體積·f))·(dV_CH4/dt)

其中V_CH4：累積甲烷產量（ml）；V_R：添加到血清瓶中的污泥體積（L）；f：化學需氧量和甲烷產量的轉換系數（350 ml-CH4/g-COD）；揮發性懸浮固體：接種物的揮發性懸浮固體濃度（g-VSS/L）；t：經過的時間（天）。

2.2.2.溶解氫特異性產甲烷活性

使用配備H2-100微傳感器的微傳感器萬用表測量溶解氫。用于此批次測定的接種物也是第134天從兩個消化器取出。將10 ml接種物添加到120 ml血清瓶中的90 ml富氫水中。轉移后，血清瓶用氫氣沖洗2分鐘以確保足夠的氫氣濃度并形成厭氧條件。隨后，在將微傳感器插入液體底部后密封血清瓶。測定在37°C水浴中進行直至氫氣濃度減少停止。同時，設置兩個沒有接種物的瓶子作為對照。

氫特異性產甲烷活性基于方程（2）計算。

特異性產甲烷活性（氫）=(f'/揮發性懸浮固體)·(dC_H2/dt)

其中C_H2：氫氣消耗濃度（mol/L）；f'：化學需氧量和氫氣消耗的轉換系數（16 g-COD/mol-H2）；揮發性懸浮固體：接種物的揮發性懸浮固體濃度（g-VSS/L）；t：經過的時間（天）。

2.3.投料間乙酸、丙酸和氫代謝及產甲烷途徑分析

為了理解投料間（24小時）乙酸的降解，在第128-130天進行了批次測定。測量了兩次連續投料間的甲烷產率、揮發性脂肪酸和溶解氫。使用標記乙酸（2-13C）的乙酸產甲烷途徑分析按照先前研究進行。接種物是第134天從兩個消化器取出。將20 ml標記乙酸溶液添加到120 ml血清瓶中80 ml接種物中。為了模擬對照和剝離消化器類似的conditions，初始乙酸基于24小時批次測試設置為7.5和15.6 g-COD/L。瓶子用氮氣沖洗，然后用丁基橡膠塞密封。每個消化器總共設置4個血清瓶，包括兩個沒有乙酸溶液的平行瓶作為參考。將瓶子在37°C培養，并收集沼氣樣品用于δ13CH4和δ13CO2的穩定碳同位素分析。重輕同位素比率（δ13C,‰）和通過CO2還原途徑產生的CH4分數（f_mc）使用基于我們先前研究的方程（3）-（5）計算。

其中R_樣本：13C/12C比率，R_標準為0.0112372；δ_CH4：測量變量；δ_ma：乙酸衍生CH4的同位素值，選擇平均值-33‰；δ_mc：CO2/H2衍生CH4的同位素值，基于α_mc值，選擇1.021給α_mc。

2.4.分析方法

總固體、揮發性固體、揮發性懸浮固體、總化學需氧量、可溶性化學需氧量和總銨態氮根據美國公共衛生協會的標準方法分析。元素質量百分比（C、H、O、N、S）、揮發性脂肪酸濃度、氣體組成（CH4和CO2）和pH如先前所述分析。CO2和CH4的穩定C同位素特征使用連接至低溫聚焦單元的連續流同位素比質譜儀分析。分析精度優于0.3‰。

游離氨氮基于方程（6）計算：

游離氨氮=(10^pH/(exp(6334/T)+10^pH))×總銨態氮

其中總銨態氮已定義，T是溫度（°K）。

2.5.微生物群落分析

為了使樣品具有代表性，在甲烷生產穩態的三個不同天（第132、133和134天）從每個消化器收集樣品（10 ml），然后混合并儲存在-20°C直至DNA提取。使用CTAB/SDS方法提取DNA，并通過1%瓊脂糖凝膠純化。DNA稀釋至10 ng/μL后通過PCR反應擴增16S rDNA。細菌和古菌的PCR反應和引物已在先前研究中呈現。純化和定量后，PCR產物通過Illumina MiSeq平臺進行配對末端測序（2x300）。根據Trimmomatic程序去除低質量和技術序列后，將清潔序列與Greengenes數據庫對齊，然后刪除嵌合體。每個樣品的序列統一選擇至25,000以消除測序深度差異。所有序列基于97%相似性分組為操作分類單元。此外，還計算了Chao1豐富度指數以及Simpson和Shannon多樣性指數以分析微生物多樣性。細菌和古菌的DNA序列已保存在NCBI SRA下，登錄號為PRJNA549383和PRJNA549391。