2.3. 分析方法

分析前，從反應(yīng)器取出的水樣立即通過0.22微米膜過濾。使用高效液相色譜（LC-20，Shimadzu，日本）與真實(shí)標(biāo)準(zhǔn)品鑒定和定量吡啶。流動(dòng)相為水-甲醇（3:7，v/v），流速為1.0毫升/分鐘，柱溫為35°C。所有樣品的進(jìn)樣體積為10微升。使用Inerstil ODS-SP C18（4.6毫米×250毫米，5微米）柱（Shimadzu，日本）進(jìn)行反相分離，檢測為分光光度法，波長254納米。NH4-N根據(jù)中國國家環(huán)保局（NEPA）標(biāo)準(zhǔn)方法（1997）分析。樣品的TOC濃度使用TOC分析儀（vario TOC，Elementar，德國）測量。乙酸濃度通過離子色譜儀（ICS-2100，DIONEX，英國）使用Ion Pac® As11-HC（4毫米×250毫米）柱和抑制電導(dǎo)檢測器測定。掃描電子顯微鏡（SEM）觀察和電化學(xué)監(jiān)測根據(jù)Ho等人（2009）和Shen等人（2012）進(jìn)行。使用微電極自動(dòng)化系統(tǒng)（PA2000，Unisense，丹麥）測量陽極生物膜中的氧濃度和pH值分布。

吡啶和TOC去除效率根據(jù)Shen等人（2015）確定，氨形成效率（FE_{NH4+-N}）由以下公式計(jì)算：

使用Excel計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。此外，為評估不同處理間是否存在顯著差異，使用SPSS軟件（版本19.0，SPSS Inc.，美國）進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）檢驗(yàn)。p值小于0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

在實(shí)驗(yàn)不同階段收集五個(gè)樣品，分別標(biāo)記為S0（初始接種物）、S1和S2（電流刺激前從陽極和陰極收集）、S3和S4（長期實(shí)驗(yàn)結(jié)束后電流刺激后從陽極和陰極收集）。用磷酸鹽緩沖鹽水（pH=7.0）洗滌后，使用FastDNA SPIN kit（MP Bio-medicals，美國）根據(jù)制造商說明提取每個(gè)樣品的基因組DNA。使用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對細(xì)菌16S rRNA的V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議通過Illumina Miseq測序平臺(tái)進(jìn)行測序。

3. 結(jié)果與討論

3.1. 啟動(dòng)過程

在啟動(dòng)期最初37天，無電流供應(yīng)下，厭氧反應(yīng)器中進(jìn)水濃度為100毫克/升時(shí)，吡啶去除效率在前17天末高于95%（圖1）。然而，當(dāng)吡啶濃度增加至300毫克/升時(shí)，僅約60%，表明高吡啶濃度對厭氧條件下其降解有負(fù)面影響。在38天提供小于0.3毫安的小電流后，陽極電位從-244±4.5毫伏增加至-150±9.5毫伏，而陰極電位從-360±5.5毫伏降低至-800±15毫伏。有趣的是，吡啶去除和NH4-N形成效率顯著從61.1%和39.3%（37天無電流時(shí)）增加至98.3%和60.7%（55天有電流時(shí)）。純電解系統(tǒng)中吡啶去除效率僅為2.3±1.0%，表明小電流電解過程對吡啶的降解幾乎可忽略。NH4-N形成是吡啶環(huán)裂解的關(guān)鍵證據(jù)，因?yàn)橄惹把芯勘砻鬟拎きh(huán)中的氮常在吡啶生物降解過程中轉(zhuǎn)化為NH4-N。然而，測得的NH4-N僅為吡啶中氮的60%，這可能是因?yàn)檫拎そ到猱a(chǎn)生的大部分NH4-N用于生物質(zhì)合成。此外，電流供應(yīng)后超過95%的TOC被去除，而厭氧條件下僅約57%的TOC被去除，表明電流刺激下厭氧條件下吡啶幾乎完全礦化。先前研究表明，電化學(xué)刺激可通過提供電極作為陽極電子受體或陰極電子供體加速有機(jī)污染物的降解。例如，電化學(xué)刺激可增強(qiáng)洛克沙胂生物降解和礦化為無機(jī)砷，促進(jìn)通過物理化學(xué)處理廢水去除砷。值得注意的是，微生物電子轉(zhuǎn)移對于電化學(xué)刺激過程中洛克沙胂降解至關(guān)重要。在本研究中，厭氧系統(tǒng)中的陽極在吡啶降解中起關(guān)鍵作用，因?yàn)檫拎さ挚刮⑸镞€原降解但更容易在陽極氧化降解中屈服。此外，在處理吡啶污染物時(shí)，電極可對微生物提供連續(xù)和精細(xì)的刺激。

圖1. 厭氧反應(yīng)器啟動(dòng)期間吡啶降解、總有機(jī)碳（TOC）去除及氨氮生成變化曲線

3.2. 關(guān)鍵操作參數(shù)的影響

3.2.1. 進(jìn)水吡啶濃度

如圖2a所示，反應(yīng)器在進(jìn)水吡啶濃度300-500毫克/升范圍內(nèi)保持良好去除性能，其中幾乎100%吡啶和95% TOC（p>0.05）被去除，約60% NH4-N（p>0.05）產(chǎn)生，表明反應(yīng)器性能變化不顯著。然而，當(dāng)進(jìn)水吡啶濃度增加至600毫克/升時(shí)，吡啶去除效率顯著從100.0%降低至89.3±1.4%（p=0.009），且NH4-N形成效率降低10%（p=0.012）。類似現(xiàn)象也在先前研究中觀察到，這可歸因于更高吡啶濃度下的更高頑固性和毒性。應(yīng)指出，原始工業(yè)廢水中吡啶濃度通常在20-500毫克/升范圍內(nèi)。電刺激厭氧系統(tǒng)中最大吡啶去除率遠(yuǎn)高于2.28摩爾/立方米·天，高于傳統(tǒng)缺氧或厭氧系統(tǒng)。例如，存在電子受體即NO3時(shí)缺氧條件下吡啶去除率為0.76摩爾/立方米·天。電刺激厭氧系統(tǒng)中的速率遠(yuǎn)高于缺氧條件1.26摩爾/立方米·天。在接種反硝化細(xì)菌的厭氧系統(tǒng)中，吡啶去除率僅為1.25摩爾/立方米·天（Rhee等人，電子受體即NO3時(shí)為0.76摩爾/立方米·天。馴化活性污泥在缺氧條件下吡啶去除率為1.26摩爾/立方米·天。在接種反硝化細(xì)菌的厭氧系統(tǒng)中，廢水中。

圖2. (a)吡啶濃度、(b)施加電流、(c)水力停留時(shí)間、(d)乙酸投加量對厭氧反應(yīng)器中吡啶降解、TOC去除及氨氮生成的影響

3.2.2. 施加電流

在階段III，通過設(shè)置其值從0到0.4毫安評估施加電流對反應(yīng)器性能的影響。無電流供應(yīng)時(shí)，吡啶、TOC去除和NH4-N形成效率分別為66.2±1.8%、64.4±0.8%和39.6±2.3%，高于系統(tǒng)啟動(dòng)期間觀察到的值。對此觀察的可能解釋是適當(dāng)?shù)闹绷麟娍纱碳の⑸锘钚圆⒋龠M(jìn)生物膜形成。隨著施加電流從0增加至0.3毫安，陽極電位從-244±4.5毫伏增加至-150±9.5毫伏。吡啶、TOC去除和NH4-N形成效率 consequently 增加至100.0%（p=0.003）、96.1±1.2%（p=0.003）和60.1±2.1%（p=0.01）（圖2b）。此觀察進(jìn)一步表明電刺激厭氧系統(tǒng)可促進(jìn)吡啶降解。然而，施加電流進(jìn)一步增加至0.4毫安對反應(yīng)器性能有顯著負(fù)面影響。陽極電位急劇增加至250±30毫伏，表明陽極上的電化學(xué)活性微生物可能在此條件下被嚴(yán)重抑制。因此，吡啶、TOC去除和NH4-N形成效率顯著降低至90.2±1.7%（p<0.001）、88.9±1.8%（p<0.001）和54.0±1.0%（p=0.002）。以上結(jié)果強(qiáng)有力地證明，當(dāng)施加合適電流到厭氧系統(tǒng)時(shí)，反應(yīng)器性能可被抑制在此條件下。因此，吡啶、TOC去除和NH4-N形成效率顯著降低至90.2±1.7%（p<0.001）、88.9±1.8%（p<0.001）和54.0±1.0%（p=0.002）。以上結(jié)果強(qiáng)有力地證明，當(dāng)施加合適電流到厭氧系統(tǒng)時(shí)，反應(yīng)器性能可被增強(qiáng)，優(yōu)化厭氧系統(tǒng)中微生物的馴化。

3.2.3. HRT

HRT是調(diào)節(jié)厭氧系統(tǒng)性能的重要參數(shù)。如果HRT過長，系統(tǒng)效率降低且建設(shè)成本增加。在階段IV，在恒定施加電流0.3毫安下評估五個(gè)不同HRT的系統(tǒng)性能。如圖2c所示，當(dāng)HRT在48-72小時(shí)范圍內(nèi)變化時(shí)，系統(tǒng)在吡啶和TOC去除方面顯示穩(wěn)定性能。隨著HRT從72小時(shí)減少至48小時(shí)，吡啶和TOC去除效率輕微從100.0%降低至95.2±1.4%，至98.1±1.0%（p=0.142）和92.4±2.1%（p=0.417），表明反應(yīng)器性能變化不顯著。系統(tǒng)中NH4-N形成效率保持高于58%（p=0.581）。然而，隨著HRT減少至36小時(shí)，吡啶和TOC去除效率實(shí)質(zhì)性降低至86.3±2.3%（p=0.004）和79.8±0.8%（p=0.005）。此外，NH4-N形成效率降低至49.3±2.5%（p=0.029）。此結(jié)果與先前觀察不一致，即中間體NH4-N在微生物燃料電池中36小時(shí)內(nèi)完全消耗。此觀察可歸因于吡啶作為厭氧系統(tǒng)中的底物，對微生物生長和存活有負(fù)面影響。HRT進(jìn)一步從36小時(shí)減少至24小時(shí)引起反應(yīng)器性能在吡啶降解（p=0.006）和TOC去除（p=0.002）以及NH4-N形成（p=0.021）方面顯著惡化。隨著HRT減少，厭氧反應(yīng)器性能下降可能由于較短HRT與較高吡啶負(fù)荷率可能嚴(yán)重抑制陽極呼吸細(xì)菌進(jìn)行乙酸氧化。先前研究表明，高吡啶負(fù)荷下微生物活性可能被嚴(yán)重抑制。

3.2.4. 乙酸鈉投加量

向厭氧反應(yīng)器補(bǔ)充共底物如乙酸鈉很重要，因?yàn)樗刮⑸镞m應(yīng)有毒吡啶，此外維持3.2.4. 乙酸鈉投加量 9.6毫摩爾，吡啶降解和TOC去除效率在電輔助厭氧系統(tǒng)中經(jīng)歷輕微增加，從85.6±1.7%和82.1±2.0%至89.5±1.3%（p=0.285）和85.2±0.9%（p=0.312）。這可能歸因于乙酸代謝微生物種群增加。然而，當(dāng)乙酸鈉投加量從9.6增加至16毫摩爾時(shí)，系統(tǒng)中吡啶和TOC去除效率顯著降低至75.2±1.6%（p=0.009）和74.1±1.6%（p=0.012）。高乙酸鈉投加量下反應(yīng)器性能惡化表明高乙酸鈉投加量不利于吡啶降解。這可能歸因于乙酸對吡啶降解有更強(qiáng)競爭效應(yīng)。同時(shí)，乙酸去除效率在整個(gè)測試期間保持約100%，表明過量乙酸可在厭氧系統(tǒng)中完全消耗。NH4-N形成效率也受乙酸鈉投加量影響。無乙酸添加時(shí)NH4-N形成效率高達(dá)56.2±2.2%，但當(dāng)乙酸濃度為16毫摩爾時(shí)降低至15.0±1.4%（p=0.04）。對此響應(yīng)的可能解釋是乙酸對微生物生長的積極影響，伴隨NH4-N消耗增加。以上結(jié)果清楚顯示，維持適當(dāng)乙酸鈉投加量可增強(qiáng)電流刺激下厭氧反應(yīng)器中吡啶降解。這是非常有用的觀察，因?yàn)閷?shí)際廢水中除吡啶外通常存在易生物降解有機(jī)物（如葡萄糖、乙酸等）。