研究簡介:在全球變暖和隨之而來的氣候危機的時代，發現可持續能源載體不僅對科學與技術研究人員來說是一項重要事業，對全人類來說都是如此。實現燃料可持續生產的一條路徑是利用分子金屬催化劑進行氫化反應（HER）和CO2還原;該領域的研究進展仍在持續。本研究旨在開發一種基于全新設計蛋白質的人工氫化酶，以實現可持續、高效的中性水相中產氫。

研究人員將鈷基分子催化劑——鈷肟（cobaloxime）通過非天然氨基酸3-甲基吡啶半胱氨酸共價連接至一個由65個氨基酸組成的三螺旋束結構蛋白α3C上，構建出一種全人工金屬酶（命名為復合物3）。該α3C蛋白屬于α3X家族，具有高度穩定的二級結構和明確的折疊構象，且在廣泛的pH范圍內保持結構完整性，是理想的人工酶支架。

研究通過MALDI-ToF質譜、圓二色譜（CD）、紫外-可見光譜及電子順磁共振（EPR）等多種手段確認了鈷肟成功配位于蛋白內部，并保留了其催化活性中心的Co(II/III)氧化還原特性。電化學測試表明，該人工酶在中性緩沖液中展現出與游離鈷肟相似的還原電位和不可逆產氫峰。

更重要的是在光電化學、電化學及化學還原（使用[Eu(EGTA)]2?作為還原劑）三種條件下，該人工酶均能有效催化質子還原生成氫氣。盡管其產氫轉化數（TON）約為游離鈷肟的80%，速率約為40%，但這是首次在完全從頭設計的非天然蛋白支架中實現多功能產氫催化。研究發現，蛋白環境對催化性能具有雙重影響：一方面可能通過空間位阻或局部微環境限制底物/質子傳輸，降低反應速率。另一方面也可能提供一定的保護作用，增強催化劑穩定性。該工作不僅驗證了小尺寸de novo蛋白作為人工金屬酶支架的可行性，也為未來理性設計高效、可規模化、基于地球豐產元素的生物啟發產氫系統提供了重要范例和基礎數據。

Unisense微電極系統的應用

采用Unisense公司的氫氣微傳感器來監測反應體系中由鈷肟催化劑（游離態2或蛋白結合態3）在[Eu(EGTA)]2?還原條件下產生的氫氣。該傳感器被直接浸入反應溶液中，能夠連續記錄溶解H?濃度隨時間的變化曲線。通過實時測量H?積累速率和總量，研究人員得以計算出人工酶（復合物3）與對照催化劑（復合物2）的產氫轉化數（TON），從而客觀比較其催化效率。測試的氫濃度數據證實了該人工酶不僅在光電催化下有效，在純化學還原條件（無光、無電極）下同樣具備HER活性，拓展了其應用場景。在pH 7和8條件下分別進行實驗，氫氣微電極提供的動力學曲線揭示了產氫速率與[Eu(EGTA)]2?有效濃度之間的關聯，幫助解釋pH對催化性能的影響機制。

實驗結論

α3C de novo蛋白支架已成功通過HER催化劑鈷肓功能化，以研究該分子框架對催化活性的影響。復合體3通過CD、紫外可見和EPR光譜、電化學和質譜法進行了表征。該蛋白-催化復合物通過光催化（使用光敏劑[Ru（bpy）3]2+和犧牲滅絕抗壞血酸，以及使用還原劑[Eu（EGTA）]2?進行化學還原，都是一種功能性HER催化劑。根據這里的研究，α3支架似乎在一定程度上影響了她的活動。在光化學和化學還原條件下，分子間電子從還原劑轉移到鈷氧化鈮似乎限制了氫的產生速率。

相比之下，鈷肟吸附于光系統I（PSI）的氫氣產生速率顯著加快。9結果顯示，2–4個非共價結合鈷酸在抗壞血酸存在下照射時，每分鐘產生氫350摩爾氫2/，100分鐘后產生5200噸氫。盡管鈷氧化肟并非共價結合，但消除擴散和分子內電子快速轉移使得氫的產生速度令人印象深刻。鑒于對PSI的研究，更高效的電子轉移到鈷氧化肟（3、SwMb和HmuO）很可能會提高氫的生成速率。除了優化電子轉移外，將可質子化氨基酸戰略性地放置在活性位點附近還能幫助質子轉移，從而提高催化速率。

這一點在一系列使用以酪氨酸或苯丙氨酸功能化的軸向吡啶的鈷氧化鈾中觀察到。在有利的靜電環境與保護鈷氧化肟完整性的蛋白質結構的空間功能之間存在微妙平衡，這決定了溶劑可及性和結構穩定性的理想折中。大自然在氫化酶（氫生成酶）中進化出了如此平衡的結構，使氫與質子之間能夠以驚人的高速和效率實現可逆的互轉化。