4討論

與單個(gè)細(xì)胞相比，間充質(zhì)干細(xì)胞球表現(xiàn)出更高的細(xì)胞存活率和營養(yǎng)因子分泌量，使其成為細(xì)胞療法中一種很有前景的移植選擇。然而，對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞球體是否含有缺氧核心，以及缺氧核心是否直接導(dǎo)致了間充質(zhì)干細(xì)胞球體的這些增強(qiáng)特性，文獻(xiàn)中還存在分歧。在這些研究中，我們確定間充質(zhì)干細(xì)胞球體內(nèi)的氧梯度與體外氧分壓相差不到10%。隨著間充質(zhì)干細(xì)胞球體大小的增加，球體內(nèi)的堆積密度降低，從而促進(jìn)了氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸。盡管如此，我們發(fā)現(xiàn)葡萄糖的消耗隨著球體尺寸的增大而發(fā)生了明顯變化。這些數(shù)據(jù)表明間充質(zhì)干細(xì)胞球體功能隨球體大小而變化，但間充質(zhì)干細(xì)胞球體功能的增強(qiáng)并不是由于球體核心缺氧所致。

假定間充質(zhì)干細(xì)胞球體內(nèi)存在缺氧核心主要是基于有報(bào)告顯示癌細(xì)胞形成的球體內(nèi)存在缺氧和壞死核心，以及最近肝細(xì)胞球體內(nèi)存在缺氧核心。我們無法將這些發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于間葉干細(xì)胞，因?yàn)榘┘?xì)胞和肝細(xì)胞都存在于高氧的龕位中，而間葉干細(xì)胞通常存在于生理氧分壓低得多的龕位中。因此，不同類型細(xì)胞能夠誘導(dǎo)壞死的氧分壓可能不同。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞球形體的應(yīng)用與癌癥球形體有很大不同，因?yàn)榍蛐误w的形成會(huì)促使間充質(zhì)干細(xì)胞分泌更多的營養(yǎng)因子，而癌癥球形體則被用作體外腫瘤模型。由于缺氧性腫瘤具有抗輻射的特性，癌癥球形體被設(shè)計(jì)成以壞死為核心，周圍為缺氧區(qū)，以有效研究治療策略。雖然我們?cè)谟?0000個(gè)或更少的間充質(zhì)干細(xì)胞形成的球體內(nèi)沒有檢測(cè)到缺氧核心，但其他報(bào)道稱間充質(zhì)干細(xì)胞球體內(nèi)的缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1a)趨于穩(wěn)定，這代表了改善細(xì)胞存活和生長因子分泌的潛在途徑。不過，這種說法是基于對(duì)直徑小于200μm的間充質(zhì)干細(xì)胞球體進(jìn)行免疫熒光染色，而且染色只發(fā)生在球體外圍，更可能是聚集應(yīng)力而非氧分壓梯度的結(jié)果。其他研究人員通過對(duì)球體橫截面進(jìn)行組織學(xué)分析來研究缺氧核心的存在，結(jié)果表明直徑達(dá)1000μm的球體內(nèi)存在增殖細(xì)胞。據(jù)我們所知，這是第一項(xiàng)直接測(cè)量間充質(zhì)干細(xì)胞球體內(nèi)氧分壓空間分布的研究，即使是由60000個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞形成的最大球體，其中心也沒有接近缺氧狀態(tài)。事實(shí)上，我們?cè)谥谱骱兄辽?5萬個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞的球體時(shí)才發(fā)現(xiàn)缺氧核心的形成。缺氧并沒有氧分壓的嚴(yán)格定義，它取決于細(xì)胞類型和生理?xiàng)l件。我們將缺氧定義為允許細(xì)胞存活和發(fā)揮功能的臨界氧分壓。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)和數(shù)值上只觀察到氧分壓的微小變化，不足以通過組織學(xué)分析引起細(xì)胞窘迫的跡象，這表明在這些球體內(nèi)沒有發(fā)生缺氧信號(hào)傳導(dǎo)。然而，由于設(shè)備的限制，這些研究是在環(huán)境空氣中進(jìn)行的，在氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)較少的體內(nèi)，誘導(dǎo)梯度可能會(huì)變得更加顯著。盡管如此，這并不會(huì)降低這些研究結(jié)果的影響，因?yàn)殚g充質(zhì)干細(xì)胞球體在環(huán)境條件下分泌營養(yǎng)因子增加的情況此前已有報(bào)道。

隨著每個(gè)球形體細(xì)胞數(shù)量的增加，堆積密度降低，形成了緊密堆積的較小球形體和松散堆積的較大球形體。這可能就是為什么氧分壓在較大的球體內(nèi)沒有顯著降低的原因，因?yàn)檩^大的細(xì)胞間空間允許氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)向球體中心運(yùn)輸。對(duì)特定癌系球形體的研究未能證明球形體大小與堆積密度之間存在這種相關(guān)性。雖然間充質(zhì)干細(xì)胞球體內(nèi)的細(xì)胞活力和肌動(dòng)蛋白介導(dǎo)的收縮力呈正相關(guān)，但這種適應(yīng)性堆積密度以前從未報(bào)道過。然而，由于分化狀態(tài)和動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件的不同，間充質(zhì)干細(xì)胞球體形態(tài)也存在差異，這兩者都可能影響整個(gè)球體的氧擴(kuò)散。氧擴(kuò)散率的增加也反映在K/D值上，因?yàn)檩^小的緊密包裹球體(每個(gè)球體含有15000個(gè)細(xì)胞)的K/D值是60000個(gè)細(xì)胞球體的兩倍多。有趣的是，雖然氧梯度并不嚴(yán)重，但增加每個(gè)球形體細(xì)胞的數(shù)量會(huì)顯著增加Caspase的活性并降低代謝活性。這與我們之前的研究結(jié)果一致，我們發(fā)現(xiàn)較小的球體具有更強(qiáng)的代謝活性和增殖能力。其他研究報(bào)告稱，改變每個(gè)球形體的細(xì)胞數(shù)對(duì)每個(gè)細(xì)胞的三磷酸腺苷(ATP)水平?jīng)]有影響；不過，這些研究是在每個(gè)球形體有500到5000個(gè)細(xì)胞的情況下進(jìn)行的，這些球形體可能還不夠大，不足以引起代謝活性的變化。

許多研究都報(bào)道了間充質(zhì)干細(xì)胞球體內(nèi)Caspase活性增加的現(xiàn)象，并推測(cè)這種現(xiàn)象是由于聚集應(yīng)力造成的。在這些研究中，我們觀察到較大的球體中Caspase水平升高，但沒有缺氧核心，而且它們表現(xiàn)出堆積密度降低，這可能是由于聚集應(yīng)力降低所致。在這些球體內(nèi)沒有檢測(cè)到凋亡的早期和中期標(biāo)志物AnnexinV。因此，細(xì)胞凋亡似乎既不是氧分壓的功能，也不是聚集應(yīng)力的功能，這表明三維聚集體中有一個(gè)獨(dú)立的中介，值得進(jìn)一步研究。

我們觀察到葡萄糖消耗量隨著球形體大小的增加而減少，細(xì)胞內(nèi)葡萄糖和6-磷酸葡萄糖也減少了，但我們通過乳酸-葡萄糖比值發(fā)現(xiàn)葡萄糖代謝沒有變化。葡萄糖消耗減少但乳酸-葡萄糖比值保持不變，這表明葡萄糖攝取受損是球形體大小的一個(gè)功能。球粒直徑是否會(huì)調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)和/或活性，或許是通過AMP激酶(其活化受葡萄糖生物利用率的調(diào)節(jié))，這是個(gè)引人入勝的可能性。之前對(duì)二維粘附間充質(zhì)干細(xì)胞的研究結(jié)果顯示，不同物種的代謝特征各不相同。同樣，一個(gè)物種中來自不同供體的間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出不同的乳酸-葡萄糖比率，這表明了代謝的異質(zhì)性。相比之下，我們發(fā)現(xiàn)球形間充質(zhì)干細(xì)胞的乳酸-葡萄糖比率與球形大小或供體無關(guān)。間充質(zhì)干細(xì)胞球體處理葡萄糖和6-磷酸葡萄糖的代謝途徑仍有待明確。乳酸-葡萄糖比率隨著每個(gè)球形細(xì)胞數(shù)量的增加而降低，這表明葡萄糖通過三羧酸(TCA)循環(huán)被完全氧化成二氧化碳。另外，葡萄糖也可轉(zhuǎn)入合成代謝途徑(磷酸戊糖途徑產(chǎn)生用于還原生物合成的NADPH或形成用于核苷酸合成的核糖-5-磷酸)。雖然目前還沒有其他研究對(duì)間葉干細(xì)胞球體的生物能進(jìn)行研究，但劉等人的研究發(fā)現(xiàn)，播種密度會(huì)影響細(xì)胞的新陳代謝。與高密度培養(yǎng)的細(xì)胞相比，低密度培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞依賴有氧糖酵解產(chǎn)生ATP，糖酵解與TCA循環(huán)的耦合減少，磷酸戊糖途徑的活性增強(qiáng)。這些結(jié)果是否能轉(zhuǎn)化為球形細(xì)胞內(nèi)的三維培養(yǎng)還需要進(jìn)一步研究，但這些數(shù)據(jù)表明，不同大小的球形細(xì)胞在減少移植到低氧微環(huán)境中形成的活性氧方面可能具有不同的能力。

隨著球形體體積增大，葡萄糖攝取量和細(xì)胞存活率降低，其中一個(gè)可能的機(jī)制是蛋白質(zhì)含量減少導(dǎo)致可用的整合素結(jié)合位點(diǎn)減少。雖然確切的機(jī)制還有待闡明，但球體形成的簡化模型涉及細(xì)胞-細(xì)胞接觸、粘附蛋白積累、ECM沉積、整合素結(jié)合和球體壓實(shí)。然而，由于間充質(zhì)干細(xì)胞球體會(huì)調(diào)整其堆積密度，以便于氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸，這就犧牲了ECM的沉積和細(xì)胞粘附的整合素位點(diǎn)。細(xì)胞基質(zhì)能增強(qiáng)細(xì)胞的存活和功能，而間葉干細(xì)胞球體的形成能促進(jìn)層粘連蛋白、彈性蛋白、1型膠原和纖連蛋白等ECM蛋白的生成。此外，我們最近證實(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞球體(每個(gè)球體含有15000個(gè)細(xì)胞)可沉積富含膠原蛋白的ECM，而間充質(zhì)干細(xì)胞的整合素與ECM的相互作用可驅(qū)動(dòng)細(xì)胞的命運(yùn)。因此，球體形成增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞功能的能力至少部分是由細(xì)胞-ECM相互作用介導(dǎo)的，而這些細(xì)胞-ECM相互作用隨著球體大小的增加而減少。這反過來又可能導(dǎo)致細(xì)胞新陳代謝下降和細(xì)胞凋亡增加。

總之，由多達(dá)6萬個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞組成的球體不會(huì)出現(xiàn)缺氧核心，這一發(fā)現(xiàn)增加了其臨床轉(zhuǎn)化的潛力。形成大型、可存活的組織構(gòu)建體的能力是組織工程領(lǐng)域面臨的一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。由于間充質(zhì)干細(xì)胞球體能適應(yīng)其堆積密度，因此不會(huì)出現(xiàn)壞死，它們是新興的生物打印領(lǐng)域前景廣闊的構(gòu)建模塊。間充質(zhì)干細(xì)胞與其他多種細(xì)胞類型形成共生關(guān)系，可應(yīng)用于各種不同的組織。