化合物

化合物(1、2、3、4、沙鉑和奧沙利鉑(l-OHP))等所有鉑(IV)化合物都溶解在MEM中，制成2mM的儲備溶液，然后在MEM中稀釋到所需濃度。順鉑和4在使用前不久溶解在MEM中，濃度為0.4mM，然后在MEM中進一步稀釋。

阿拉瑪藍測定

對于單層細胞的測試，CH1/PA-1、HCT116和HT1080細胞在處理前24小時從培養瓶中胰蛋白酶化收獲，并在MEM中播種到96孔微量培養板(Falcon)中，密度分別為每孔1×103個(CH1/PA-1)、2×103個(HCT116)、3×103個(HT1080)存活細胞。在三維培養物中進行試驗時，直接在培養板中處理直徑符合要求的球體。

在處理單層和球形細胞時，制備受試化合物的儲備溶液并逐步稀釋以獲得稀釋系列。每孔加入100mL稀釋液，然后在37℃和5%CO2下培養96小時。配制440mM(E110mg mL1)的復氮脲酸鈉(Sigma Aldrich)PBS新鮮溶液，每孔加入20mL。在37℃和5%CO2下染色4小時(單層實驗)或過夜(球形實驗)。

ICP-MS

化學品。ICP-MS測量的所有稀釋液均使用Milli-Q水。硝酸在石英亞沸點蒸餾裝置中進一步凈化。用于ICP-MS測量的鉑和錸標準物質購自CPI International。Tissue-Tek培養基用于包埋冷凍切片。所有其他試劑和溶劑均來自商業渠道，使用時無需進一步純化。

ICP-MS測量。使用ICP-MS儀器測定了球體內和小鼠組織中的總鉑含量。ICP-MS儀器配有CETAC ASX-520自動進樣器和MicroMist霧化器，樣品吸收率約為每分鐘0.25毫升1。每天對儀器進行調試，并將錸作為鉑的內標，以考慮儀器波動和基質效應。儀器參數見表4。數據處理使用Agilent MassHunter軟件包。

在使用LA-ICP-MS進行生物成像時，使用三重四極桿ICP-MS Agilent 8800記錄數據，儀器參數見表4。

積聚研究樣品制備(ICP-MS)。用20mM的化合物1-4處理球形體4小時，然后收獲并轉移到1.5mL Eppendorf管中(每管10個球形體，平均直徑450毫米)。用1mL PBS沖洗3次后，用400mL HNO3裂解球形體1小時，然后用Milli-Q水灌至最終體積為8mL。使用表4中列出的儀器參數，用ICP-MS測定鉑的總含量。

用ICP-MS測定小鼠組織中的鉑濃度。使用微波系統Discover SP-D用亞沸騰硝酸消化小鼠組織樣本(腫瘤、腎、肝、肺、肌肉)和血液顆粒。使用的微波參數如下：溫度：200℃；斜坡時間：4分鐘；保持時間：6分鐘：消化后的樣品用Milli-Q水稀釋，使硝酸濃度低于3%，鉑濃度低于15納克g1。使用ICP-MS測定總鉑含量，儀器參數見表4。

利用LA-ICP-MS對多細胞球和小鼠腫瘤樣本進行生物成像。用1-5mM(亞毒性濃度)化合物處理96小時后，收獲球體并將其轉移到1.5mL Eppendorf管中(每管10-20個球體)，然后用PBS沖洗3次。最后一次洗滌后，完全去除PBS，在Eppendorf管中小心地注入0.5-1mL Tissue Tek(Sakura)，然后在80℃下冷凍。用1mL胰盼藍標記球形細胞。取出皮下異種移植物并冷凍至80℃。為了進行LA-ICP-MS測量，使用冷凍切片機將樣本冷凍切成厚度為20毫米的薄片，放在玻璃載玻片上并風干。用蘇木精-伊紅(H&E)染色各器官5毫米的連續切片，用于組織學評估。

使用波長為213nm的Nd:YAG固體激光器來獲取鉑金在球體和腫瘤切片中的空間分布。測量前生成了感興趣區域的光學樣本圖。為確保樣品材料的完全消融，對每個樣品的輸出激光能量進行了單獨調整。消融采用平行線掃描，線與線之間的間距為10毫米。對于腫瘤切片，頻率為10Hz，光斑大小為70mm，掃描速度為40mm/s；而對于球形樣本，激光參數調整為20Hz，光斑大小為10mm，掃描速度為10mms1。燒蝕的樣品材料以每分鐘400毫升1的流速與氦氣(質量5.0)一起轉移到ICP-MS儀器中。使用ICP-MS儀器記錄數據，儀器參數見表4。Igor Pro軟件及其附加軟件Iolite用于進一步處理數據和生成鉑分布圖。根據作者的手冊，采用了"Trace_Elements"數據縮減方案，包括空白減去和不平滑可視化。

缺氧檢測

用丙酮固定腫瘤切片，并按照Hypoxyprobet-1 Kit(hpi)方案進行染色。在共聚焦顯微鏡Leica CLSM中使用在PBST中稀釋為1:1000的Alexa Flour 647標記的二抗進行熒光檢測。由于細胞內聚力差，球體切片經不起固定，而且使用Hypoxyprobet-1試劑盒需要清洗步驟，因此按照之前的描述，用HIF-1 alpha抗體對整個球體進行染色。

缺氧室

在單層培養中進行缺氧誘導時，將細胞播種到96孔板中，讓其附著24小時，然后在缺氧室中處理，通過氮氣置換將氧氣水平降至0.5%。細胞在氧氣含量為0.5%的低氧室中處理96小時。

動物實驗

6至8周大的雄性SCID小鼠飼養在無病原體環境中，所有操作均在層流氣流柜中進行。在局部腫瘤生長實驗中，將HT1080細胞(1×106個)皮下注射到動物右側腹部。動物被隨機分配到治療組，當腫瘤結節達到B100 mm3時開始治療。動物分別在第4、7、11和14天接受1號(靜注8.3mg kg1，溶于5%DMSO)、2號(靜注9.1mg kg1，溶于5%DMSO)或沙鉑(靜注10mg/kg，溶于5%DMSO)治療。對照組動物腹腔注射水。每天檢查動物是否出現不適癥狀，并通過卡尺測量定期評估腫瘤大小。腫瘤體積的計算公式為(長寬2)/2。

第15天，動物接受波硝唑(60毫克千克1毫升，溶于0.9%Na.溶于0.9%氯化鈉)，30-60分鐘后處死。為此，小鼠被麻醉并通過心臟穿刺采血。

氧氣和氧化還原微電極測量

在用測量微電極時，用無菌過濾的PBS沖洗球體一次，然后用1PBS制備的1%瓊脂糖重懸。將懸浮的球體等分到預熱(37℃)的培養皿中，培養皿中含有1厘米厚的PBS-瓊脂糖(1%)層。在循環水浴中進行微電極測量時，樣品保持在37℃。

使用微電極(尖端直徑10微米；Unisense)測量氧氣和氧化還原電位曲線。微傳感器的校準和測量按照制造商的說明，通過微傳感器隨附的軟件界面(Unisense)進行。微傳感器的校準使用測量前生成的兩點標準曲線中的外部標準。

測量氧氣時，在20攝氏度下對水進行劇烈曝氣，以獲得飽和氧氣讀數。通氣5分鐘后，停止鼓泡并記錄重復測量值。根據溶液溫度和鹽度，使用微型傳感器軟件計算飽和氧氣濃度。制備含0.1M NaOH中0.1M抗壞血酸鈉的缺氧溶液，并進行重復測量。氧氣分布的測量步長為20毫米，每步總測量時間為4秒。

氧化還原微傳感器用pH值為4.0和7.0的標準喹氫酮飽和溶液(10克/L)進行校準。氧化還原測量使用銀/氯化銀參比電極進行。將微傳感器固定在二維微剖面系統(Unisense)中，并使用SensorTrace Suite軟件進行控制，從而收集深度剖面圖。氧化還原測量的步長為30毫米，每個步長的總測量時間為14秒。