摘要

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體(VEGFR)在鼻咽癌中高度表達，因此，阻斷VEGF和VEGFR的結(jié)合可能是治療鼻咽癌的一種潛在方法。阿帕替尼可抑制腫瘤血管生成。以往的研究表明，阿帕替尼對鼻咽癌有抗腫瘤作用。本研究將探討阿帕替尼聯(lián)合放療的效果。本研究將注射了CNE-2鼻咽癌細(xì)胞的裸鼠隨機分為6組。通過評估腫瘤抑制率、血管內(nèi)皮生長因子受體-2磷酸化、CD31、氧分壓和腫瘤代謝來評估治療效果。我們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，治療組小鼠的腫瘤抑制效果更好。在單用阿帕替尼治療的小鼠中，血管生成被阻止，腫瘤組織氧分壓降低，從而達到抗腫瘤效果。此外，聯(lián)合治療的抑瘤效果比單獨使用阿帕替尼或放療更強。與單藥治療相比，聯(lián)合治療能更好地抑制血管生成。阿帕替尼聯(lián)合放療治療鼻咽癌具有協(xié)同作用，這可能與增強抗血管生成有關(guān)。

引言

鼻咽癌(NPC)起源于鼻咽上皮細(xì)胞，在種族和地理分布上存在異常差異。中國南部、東南亞、北非和太平洋島嶼的發(fā)病率最高。由于鼻咽癌的解剖位置和放射敏感性，放療仍是鼻咽癌的首選治療方法。隨著放療設(shè)備和技術(shù)的不斷更新和進步，鼻咽癌的存活率已大大提高。然而，仍有一些患者對放療產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致鼻咽癌治愈率下降。因此，減少放療耐藥性可能是提高鼻咽癌治療效果的關(guān)鍵目標(biāo)。

放療的主要功能是破壞雙鏈DNA，使蛋白質(zhì)受阻或啟動細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。氧氣是一種有效的放射性敏化劑，可在照射過程中釋放出來，促進活性氧/自由基的產(chǎn)生，造成DNA的嚴(yán)重?fù)p傷。隨著腫瘤的生長，腫瘤微環(huán)境缺乏足夠的血液供應(yīng)，導(dǎo)致低灌注和缺氧。臨床數(shù)據(jù)顯示，腫瘤組織缺氧與許多腫瘤(包括頭頸部腫瘤)的治療效果不佳有關(guān)。因此，改善鼻咽癌腫瘤組織的血液供應(yīng)和氧氣輸入可顯著提高鼻咽癌放療的療效。

血管生成是腫瘤發(fā)生過程中新血管形成的一個多步驟過程。血管生成因子包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子和胰島素樣生長因子。其中，血管內(nèi)皮生長因子受體-2(VEGFR-2)是血管生成的主要信號傳感器。在血管內(nèi)皮生長因子的刺激下，VEGFR-2在羧基末端和激酶插入?yún)^(qū)磷酸化，從而促進血管生成。在大多數(shù)鼻咽癌患者中，VEGF/VEGFR復(fù)合物被發(fā)現(xiàn)過度表達，這與鼻咽癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險增加和存活時間縮短有關(guān)。

阿帕替尼是一種小分子VEGFR-2酪氨酸激酶抑制劑，可高度選擇性地競爭VEGFR-2的三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合位點，抑制VEGFR-2的磷酸化(p-VEGFR2)，阻斷VEGF及其受體結(jié)合的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。它能強烈抑制腫瘤血管生成，發(fā)揮抗腫瘤作用。Jain證明，抗血管生成藥物具有重塑血管系統(tǒng)的作用，可形成血管"正常化"的"時間窗口"。在"時間窗"內(nèi)，抗血管生成藥物短暫改善腫瘤血管系統(tǒng)的功能，從而增加與氧的相互作用，降低間質(zhì)的壓力。這為抗血管生成藥物與放療的結(jié)合奠定了理論基礎(chǔ)。Teicher等人率先證明，抑制血管生成可增強放療的療效。此外，Peng等人證實，阿帕替尼通過抑制VEGFR-2降低腫瘤微血管密度，增加細(xì)胞凋亡，對CNE-2型鼻咽癌有抗腫瘤作用。關(guān)于阿帕替尼與放療聯(lián)合使用及其對鼻咽癌的協(xié)同抗腫瘤作用的研究報告還很有限。本研究旨在探討阿帕替尼聯(lián)合放療治療鼻咽癌的效果，并為今后的研究和臨床實踐提供指導(dǎo)。

材料與方法

細(xì)胞系和小鼠

CNE-2NPC細(xì)胞由西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院實驗中心提供，在羅斯威爾公園紀(jì)念研究所(RPMI)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為37℃，二氧化碳濃度為5%。對所用細(xì)胞進行了支原體檢測，未發(fā)現(xiàn)支原體感染。培養(yǎng)基每3天更換一次。

BALB/c雌性裸鼠(4-5周齡，18.85±2.15g)購自騰信生物科技有限公司。小鼠飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院動物研究中心。實驗前一周，動物被嚴(yán)格飼養(yǎng)在空氣潔凈的層流架上，處于恒溫(24℃±2℃)、恒濕(50%±10%相對濕度)和特定的無病原體環(huán)境中。小鼠籠、空氣過濾罩、墊料、食物和飲用水均在無菌環(huán)境中消毒和更換。

藥物及主要試劑

阿帕替尼由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供。抗CD31單克隆抗體購自Bio World Technology Co Ltd，抗血管內(nèi)皮生長因子受體-2磷酸化(p-VEGFR-2)單克隆抗體(Tyr951)購自上海細(xì)胞信號技術(shù)有限公司，抗體由兔抗血清親和純化，稀釋倍數(shù)為1:50至1:200。

腫瘤模型的建立和實驗設(shè)計

將指數(shù)期CNE-2細(xì)胞調(diào)整為每0.1mL 1×107個，然后注射到BALB/c裸小鼠的右大腿上。當(dāng)腫瘤平均體積達到150至200mm3時，小鼠被隨機分為6組(每組8只)，并接受以下治療：(1)第1-7天對照組每天注射0.1mL生理鹽水(NS)；(2)第1-7天阿帕替尼組每天注射200mg/kg；(3)單次放療6 Gy組：第1-7天每天0.1mL NS，第8天接受單次放療(6 Gy)；(4)單次放療12 Gy組：第1-7天每天0.1mL NS，第8天接受單次放療(12 Gy)：(5)阿帕替尼+6 Gy組：第1-7天阿帕替尼200mg/kg，第8天單次放療(6 Gy)；(6)阿帕替尼+12 Gy組：第1-7天阿帕替尼200mg/kg，第8天單次放療(12 Gy)。阿帕替尼的溶劑為NS，NS和阿帕替尼均通過灌胃給藥。

每3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤沿主軸(a)和次軸(b)的直徑(毫米)，并根據(jù)Steel公式V=0.5×a×b2計算腫瘤體積(V；mm3)。治療開始18天后，小鼠頸椎脫位安樂死，腫瘤生長抑制率計算如下：(1-實驗組平均體積/對照組平均體積)×100%。兩種治療方法的聯(lián)合效果用Q表示：Q=E(A+B)/[EA+(1-EA)×EB]，其中E(A+B)代表聯(lián)合組的抑制率，EA和EB分別代表阿帕替尼或放療的抑制率。Q<0.85表示兩種治療效果相互拮抗，0.85<Q<1.15表示兩種治療效果相加，而Q>1.15表示兩種治療效果協(xié)同。