如圖3(C)所示，氧化石墨烯進(jìn)入胚胎后，最初出現(xiàn)在胚胎周圍，并選擇性地定位在卵黃囊、心臟、眼睛和尾部；此外，它還富集在血管中。這與氧化石墨烯家族納米材料主要在小鼠的肺、肝和脾臟中積累，并在血管中富集的報(bào)告一致。據(jù)報(bào)道，許多納米粒子都會(huì)影響斑馬魚胚胎的早期發(fā)育，當(dāng)胚胎暴露于AgNPs、SiNPs、CNTs和富勒烯時(shí)會(huì)導(dǎo)致畸形。在本研究中，觀察到了三種典型的畸形，包括心包/卵黃囊水腫、尾部彎曲和眼睛/頭部畸形，這與氧化石墨烯在胚胎中的定位一致。去除絨毛后，在用1mg/L氧化石墨烯處理的胚胎中也觀察到了這三種典型的畸形，這表明氧化石墨烯可在斑馬魚胚胎發(fā)育過(guò)程中誘導(dǎo)畸形。此外，尾部/脊髓彎曲、心包/卵黃囊水腫和眼/頭畸形的發(fā)生率隨氧化石墨烯濃度的增加而增加；心包/卵黃囊水腫的情況尤其如此。然而，如上所述，胚胎中氧化石墨烯的積累并沒(méi)有隨著氧化石墨烯濃度的增加而增強(qiáng)。絨毛膜中的氧濃度隨著氧化石墨烯濃度的增加而降低，這表明缺氧增強(qiáng)了氧化石墨烯的毒性。這些結(jié)果還表明，缺氧誘發(fā)的畸形具有選擇性，通常在心包/卵黃囊(水腫)和頭部觀察到更多的畸形，這可能是因?yàn)樾呐K和大腦比其他器官對(duì)缺氧更敏感。有趣的是，尾部/脊髓彎曲的發(fā)生率最初隨著氧化石墨烯濃度的增加而增加，后來(lái)隨著氧化石墨烯濃度的增加而減少。這些獨(dú)特的結(jié)果不同于之前用鎘和二氧化鈦納米粒子得出的結(jié)果，后者會(huì)隨著濃度的增加而持續(xù)增強(qiáng)尾部/脊髓彎曲。同樣，與對(duì)照組胚胎相比，暴露于1毫克/升氧化石墨烯的胚胎的心率明顯降低；但與對(duì)照組胚胎相比，暴露于100毫克/升氧化石墨烯的胚胎的心率卻有所提高。在更嚴(yán)重的缺氧壓力下，為了增加氧氣供應(yīng)，用100毫克/升氧化石墨烯處理的胚胎的心率增加了。納米銀顆粒或納米磷顆粒沒(méi)有觀察到這一現(xiàn)象，隨著其濃度的增加，心率會(huì)穩(wěn)步降低。

細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是納米材料的一種普遍不良影響，與各種疾病和毒性有關(guān)。氧化應(yīng)激(包括ROS生成)是與氧化石墨烯相關(guān)的主要不良效應(yīng)，被認(rèn)為是細(xì)胞死亡的最可能機(jī)制。識(shí)別特定器官的細(xì)胞凋亡和ROS對(duì)于解釋和理解相關(guān)疾病或不良反應(yīng)(如心率異常和畸形)至關(guān)重要。在本研究中，ROS和細(xì)胞凋亡在氧化石墨烯定位的特定區(qū)域都有所增加，這表明氧化石墨烯的積累可能會(huì)導(dǎo)致斑馬魚胚胎發(fā)育過(guò)程中的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。

石墨烯能夠通過(guò)激活線粒體途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS并隨后引發(fā)細(xì)胞凋亡，這支持了我們的結(jié)果，即細(xì)胞凋亡隨著ROS的產(chǎn)生和線粒體的損傷而增加(圖3和圖6)。碳納米管(CNTs)可能會(huì)在體內(nèi)或體外導(dǎo)致ROS生成和毒性效應(yīng)，這主要是由于表面缺陷的存在。同樣，結(jié)構(gòu)缺陷也被認(rèn)為在石墨烯系列材料的毒性中起著重要作用，這主要是因?yàn)榭腕w原子或分子具有很高的活性。此外，在本研究中觀察到，氧化石墨烯具有鋒利的齒狀邊緣(圖1C)；因此，氧化石墨烯可能會(huì)通過(guò)直接的物理過(guò)程破壞線粒體膜并誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS。據(jù)報(bào)道，這些鋒利的邊緣可直接使細(xì)胞、細(xì)菌和病毒的膜破裂，從而對(duì)生物體造成物理?yè)p傷。此外，缺氧環(huán)境還可能誘導(dǎo)產(chǎn)生過(guò)多的ROS和細(xì)胞凋亡，并改變動(dòng)物和人類胚胎的能量代謝和自我更新。這些結(jié)果表明，在胚胎發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生ROS、導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和誘發(fā)畸形的途徑有很多。然而，ROS的產(chǎn)生與線粒體損傷密切相關(guān)，這主要是因?yàn)榫€粒體是斑馬魚胚胎中產(chǎn)生ROS的主要細(xì)胞器。

過(guò)量產(chǎn)生的ROS明顯抑制了SOD的活性，增加了MDA的含量，造成了氧化應(yīng)激。先前的研究表明，新生DNA鏈中鳥嘌呤的氧化損傷會(huì)抑制DNA甲基化，降低DNA甲基化水平。在本研究中，經(jīng)1mg/L氧化石墨烯處理的胚胎的DNA整體甲基化水平顯著降低，8-OHdG加合物的水平升高。DNA甲基化水平的降低可能會(huì)改變基因表達(dá)，從而導(dǎo)致發(fā)育異常，如畸形和細(xì)胞凋亡。因此，接觸氧化石墨烯引發(fā)的異常DNA甲基化模式可能是氧化石墨烯對(duì)胚胎產(chǎn)生毒性的潛在機(jī)制。濃度為100毫克/升的氧化石墨烯會(huì)導(dǎo)致8-HOdG加合物和DNA甲基化水平升高，這意味著氧化石墨烯對(duì)胚胎的毒性機(jī)制是復(fù)雜的。

結(jié)論

氧化石墨烯特異性地包裹和滲透絨毛膜，導(dǎo)致絨毛膜缺氧，并在斑馬魚胚胎發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生毒性。包膜效應(yīng)直接導(dǎo)致胚胎附近形成明顯缺氧的微環(huán)境，氧化石墨烯對(duì)絨毛膜表面施加機(jī)械力。與此同時(shí)，胚胎的自發(fā)運(yùn)動(dòng)也減弱了，這也與氧化石墨烯的包裹作用有關(guān)。這些不利影響最終導(dǎo)致了斑馬魚胚胎發(fā)育過(guò)程中的孵化延遲。氧化石墨烯可誘導(dǎo)ROS、細(xì)胞凋亡、心包/卵黃囊水腫和尾部/脊髓彎曲，其作用與濃度有關(guān)。進(jìn)入胚胎后，氧化石墨烯選擇性地定位于卵黃囊、心臟、眼睛和尾部。氧化石墨烯會(huì)破壞線粒體，干擾抗氧化酶的活性，誘導(dǎo)ROS生成和脂質(zhì)過(guò)氧化，并導(dǎo)致這些區(qū)域的細(xì)胞凋亡和畸形。此外，氧化石墨烯還誘導(dǎo)形成8-OHdG加合物，改變DNA甲基化。這項(xiàng)工作探討了氧化石墨烯對(duì)胚胎發(fā)育的具體不利影響，并強(qiáng)調(diào)了氧化石墨烯對(duì)生態(tài)和健康的潛在風(fēng)險(xiǎn)。