討論

絨毛膜是一種特殊的生物物質，在斑馬魚72hpf之前一直圍繞著胚胎，它可以保護胚胎并充當防止與納米粒子接觸的第一道屏障。我們最近的研究表明，石墨烯基材料可直接與植物細胞表面的氨基發生相互作用；但對于絨毛膜來說，這種相互作用尚不明確。在本研究中，我們使用光學顯微鏡、掃描電鏡和傅立葉變換紅外光譜研究了氧化石墨烯與絨毛膜之間的相互作用。光學顯微鏡圖像顯示，氧化石墨烯吸附在絨毛和胚胎表面(圖2)。形成的透明氧化石墨烯層覆蓋了突起并包裹了絨毛，導致突起之間的孔道堵塞(圖2B)。胚胎經1mg/L氧化石墨烯處理后，絨毛膜上的一些官能團發生了變化，例如，羥基和C=O基團的數量增加了，這表明氧化石墨烯在絨毛膜上的吸附可能是由于羥基之間的相互作用而發生的。

絨毛膜孔道的堵塞導致絨毛膜與培養基分離，進而影響胚胎發育。在本研究中，用氧化石墨烯處理的胚胎出現了孵化延遲、心臟功能障礙和畸形。然而，胚胎與環境隔離所產生的負面影響尚不明確。因此，我們測量了絨毛膜微環境的氧濃度和對胚胎的損害。隨著氧化石墨烯濃度的增加，胚胎中逐漸形成了缺氧微環境，這與絨毛表面的孔被堵塞以及氧化石墨烯對絨毛的包裹程度是一致的(圖2)。氧化石墨烯濃度為1毫克/升時，氣孔未被堵塞，絨毛膜和胚胎附近的氧氣濃度與對照沒有顯著差異(p<0.05)。然而，隨著氧化石墨烯濃度的增加，堵塞程度增加，胚胎附近的氧氣濃度明顯降低(p<0.05)。最后，當胚胎暴露于100mg/L氧化石墨烯時，絨毛膜表面被完全包裹，絨毛膜附近區域和胚胎都明顯缺氧(p<0.05)，這表明氧化石墨烯完全包裹后，胚胎發育所需的氧氣供應不足。

這些數據表明，絨毛膜的缺氧程度隨著氧化石墨烯濃度的增加而增加，且呈劑量依賴性(圖2)。此外，去掉絨毛后，含有胚胎和氧化石墨烯的溶液中的氧氣濃度與對照沒有顯著差異。這些數據表明，缺氧微環境主要是由于絨毛被氧化石墨烯包裹所致。有趣的是，靠近胚胎的絨毛膜中的氧濃度與胚胎在48hpf之前的自發移動有明顯的正相關(R2=0.84)，這可能會影響隨后的孵化。

先前的研究報告指出，當斑馬魚胚胎暴露于120毫克/升的單壁碳納米管(SWCNTs)和3毫克/升的羥基磷灰石納米顆粒時，會出現孵化延遲。相比之下，單壁碳納米管在100毫克/升的濃度下不會影響斑馬魚胚胎的孵化。這些矛盾可能是由于納米材料的理化性質和暴露水平的不同造成的，如它們的化學成分、純度、尺寸、表面電荷、形狀和結構。在本研究中，使用100mg/L含有0.02%S和0.01%K的高純度氧化石墨烯處理的胚胎出現了孵化延遲。因此，對胚胎發育的負面影響主要歸因于氧化石墨烯與生物體之間的相互作用。一般來說，孵化延遲可能是由于絨毛膜的彈性改變、孵化酶受到抑制、缺氧或自發運動減少造成的。氧化石墨烯片可對絨毛膜表面施加機械力，從而改變絨毛膜的彈性(圖2B)。氧化石墨烯包膜還在絨毛膜中創造了缺氧微環境(圖2C)，并誘導了孵化延遲。之前的研究表明，與暴露于常氧處理的胚胎相比，暴露于低氧環境的沙螺(Polinicessordidus)和黑鯛魚(Acanthopagrusbutcheri)胚胎顯示出孵化延遲。此外，與對照組相比，經100mg/L氧化石墨烯處理的胚胎在48hpf時的自發運動明顯減少(圖4C)，這是胚胎孵化延遲的另一個原因。此外，氧化石墨烯誘導心包和卵黃囊水腫，這可能干擾了孵化酶的活性(圖4D)。雖然1毫克/升和10毫克/升的氧化石墨烯會誘發這些畸形，但這些濃度的氧化石墨烯并不影響斑馬魚胚胎的孵化，這表明在本研究中，孵化酶的紊亂并不是導致孵化延遲的決定性因素。

為了檢查氧化石墨烯在胚胎中的遷移情況，使用氧化石墨烯-F進行了共聚焦顯微鏡觀察。鑒于氧化石墨烯-F的熒光強度遠高于游離的FITC，而且熒光強度隨濃度的增加而線性增加，胚胎中的熒光信號應該是由于氧化石墨烯-F的摻入造成的。這一結果揭示了絨毛膜抵抗氧化石墨烯入侵的能力有限，石蠟切片、TEM和拉曼光譜的結果也證實了這一點(圖3B-G)。氧化石墨烯滲透絨毛膜的機制仍不清楚。之前有報道稱，銀納米粒子(5-46nm)可通過被動擴散穿過斑馬魚絨毛膜的孔道。TEM圖像支持上述假設，即氧化石墨烯自發地通過被動擴散穿透絨毛膜，因為絨毛膜是一個無細胞包膜。然而，與銀納米粒子(NPs)不同的是，氧化石墨烯是通過獨立的孔道穿透絨毛膜的，如圖3(B)所示。

先前的研究表明，石墨烯或氧化石墨烯主要通過內吞作用內化到人體細胞中，并依賴于吸收。在本研究中，用1mg/L氧化石墨烯處理的胚胎中觀察到了含有氧化石墨烯的囊泡(圖3B3)，這支持了上述假設，表明氧化石墨烯是通過內吞作用被斑馬魚胚胎吸收的。在這項研究中，直徑約為101到258nm(平均為147nm)的氧化石墨烯粒子適合被細胞吸收。然而，隨著氧化石墨烯濃度的增加，氧化石墨烯在胚胎中的積累并沒有增強。這一結果與Shang等人的報告不一致，他們認為石墨烯量子點(GQDs)以濃度和時間依賴的方式被人類神經干細胞吸收。暴露于高濃度石墨烯量子點的胚胎積累減少，可能是因為石墨烯量子點在E3溶液中的穩定性降低，聚集性增強，而E3溶液中含有無機離子(Na+、K+、Mg2+和Ca2+)，阻礙了石墨烯量子點穿透絨毛膜。在這種情況下，絨毛膜有能力抵御高濃度石墨烯的入侵。最近的一項研究通過數學建模提出，石墨烯微片是通過邊緣尖角和角落的自發膜滲透進入細胞的。雖然在這項研究中沒有觀察到氧化石墨烯直接自發的膜穿透，但如圖3(B1)所示，氧化石墨烯穿透絨毛膜進入胚胎的模式是可能的。