The transcription factors ActR and SoxR differentially affect the phenazine tolerance of Agrobacterium tumefaciens

轉(zhuǎn)錄因子ActR和SoxR差異性地影響農(nóng)桿菌對(duì)phenazine的耐受性

來(lái)源：Molecular Microbiology, Volume 112, Issue 1, 2019, Pages 199-218

《分子微生物學(xué)》，第112卷，第1期，2019年，199-218頁(yè)

 

摘要

土壤細(xì)菌在土壤環(huán)境中經(jīng)常會(huì)遇到氧化還原活性化合物，例如吩嗪類(lèi)物質(zhì)，這些化合物能夠引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，但不同細(xì)菌物種耐受這些化合物的具體機(jī)制目前尚未完全明確。本研究在土壤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子ActR和SoxR，它們?cè)趯?duì)吩嗪的耐受性中發(fā)揮著截然不同但又互補(bǔ)的作用。ActR通過(guò)主動(dòng)促進(jìn)能量效率更高的末端氧化酶的表達(dá)，同時(shí)抑制效率較低的替代氧化酶，來(lái)增強(qiáng)對(duì)吩嗪的耐受能力，這一機(jī)制可能影響吩嗪從電子傳遞鏈中提取電子的速率，從而減少活性氧的生成。另一方面，SoxR則通過(guò)誘導(dǎo)多種外排泵和氧化還原相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)響應(yīng)吩嗪脅迫，這些基因包括超氧化物歧化酶的一個(gè)拷貝以及五個(gè)新發(fā)現(xiàn)的調(diào)控子成員，這些成員無(wú)法通過(guò)計(jì)算方法預(yù)測(cè)。值得注意的是，在低濃度吩嗪條件下，ActR的缺失比SoxR的缺失對(duì)細(xì)菌的損害更大，并且會(huì)增加對(duì)原本功能冗余的SoxR調(diào)節(jié)的超氧化物歧化酶的依賴性。這些結(jié)果表明，細(xì)菌電子傳遞鏈的組成可能是決定其對(duì)氧化還原活性化合物敏感或耐受的關(guān)鍵因素。

 

研究目的

研究目的是識(shí)別在Agrobacterium tumefaciens中對(duì)phenazine耐受性必要的基因，并理解轉(zhuǎn)錄因子ActR和SoxR的機(jī)制，特別是它們?nèi)绾尾町愋缘赜绊憣?duì)pyocyanin（PYO）和其他redox-active molecules的耐受性，以揭示土壤細(xì)菌應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的策略。

 

研究思路

研究思路通過(guò)轉(zhuǎn)座子誘變篩選對(duì)PYO敏感的突變體，從約5000個(gè)突變體中識(shí)別出12個(gè)敏感突變體，并聚焦于actR和soxR突變體。使用體外缺失突變體（△actR和△soxR）進(jìn)行生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，比較它們對(duì)多種redox-active molecules的敏感性。通過(guò)RNA-seq和qRT-PCR分析轉(zhuǎn)錄組，鑒定SoxR regulon和ActR調(diào)節(jié)的基因。測(cè)量氧消耗率、ATP水平、NADH/NAD+比率等生理參數(shù)，以評(píng)估ETC效率和氧化應(yīng)激響應(yīng)。使用丹麥Unisense電極測(cè)量溶解氧濃度，以量化呼吸速率。

 

測(cè)量的數(shù)據(jù)及研究意義

1 生長(zhǎng)曲線數(shù)據(jù)：來(lái)自Fig. 1和Fig. 2。顯示△actR在低濃度PYO（10μM）下就敏感，而△soxR僅在 high concentration（200μM）下敏感。研究意義在于表明ActR在基礎(chǔ)耐受中更重要，而SoxR在高應(yīng)激下才關(guān)鍵。

 

 

2 基因表達(dá)數(shù)據(jù)：來(lái)自Fig. 3和Fig. 4。通過(guò)qRT-PCR和RNA-seq，顯示SoxR調(diào)節(jié)多個(gè)基因（如sodBII、mexEF等），包括新發(fā)現(xiàn)的 cryptic members。ActR缺失導(dǎo)致cyo operon下調(diào) and cyd operon上調(diào)。研究意義在于揭示SoxR regulon的擴(kuò)展和ActR對(duì)ETC組成的調(diào)節(jié)，影響耐受性。

 

 

3 氧消耗率數(shù)據(jù)：來(lái)自Fig. 6A。使用Unisense OX-500微電極測(cè)量，顯示W(wǎng)T和△actR在有無(wú)PYO下的氧消耗率相似。研究意義在于表明呼吸速率不變，但ETC效率可能不同，影響ATP合成。

 

4 ATP水平數(shù)據(jù)：來(lái)自Fig. 6C。顯示△actR和△cyo突變體ATP水平降低，PYO處理進(jìn)一步降低ATP。研究意義在于證實(shí)ActR通過(guò)調(diào)節(jié)ETC影響能量守恒，耐受性依賴足夠的ATP用于防御機(jī)制。

5 SOD依賴性數(shù)據(jù)：來(lái)自Fig. 6D。顯示△actR缺失增加對(duì)SoxR調(diào)節(jié)的sodBII的依賴。研究意義表明ActR缺失導(dǎo)致更多超氧化物產(chǎn)生，需要SOD保護(hù)。

 

結(jié)論

1 ActR通過(guò)調(diào)節(jié)ETC組成（如促進(jìn)cytochrome o oxidase）來(lái)預(yù)先緩解phenazine毒性，提高能量效率，減少ROS生成。

2 SoxR通過(guò)誘導(dǎo)外排泵、SOD和其他氧化還原基因來(lái)響應(yīng)phenazine應(yīng)激，但功能冗余，僅在 high concentration 下關(guān)鍵。

3 ETC組成是耐受redox-active compounds的主要決定因素，ActR的 proactive 調(diào)節(jié)比SoxR的 inducible 響應(yīng)更基礎(chǔ)。

 

使用丹麥Unisense電極測(cè)量數(shù)據(jù)的研究意義

使用丹麥Unisense OX-500微電極測(cè)量溶解氧濃度，用于量化氧消耗率（Fig. 6A）。研究意義在于直接評(píng)估phenazine對(duì)細(xì)胞呼吸的影響。測(cè)量顯示W(wǎng)T和△actR在有無(wú)PYO下的氧消耗率相似，表明呼吸速率未顯著改變，但結(jié)合ATP數(shù)據(jù)，提示ETC效率降低（如質(zhì)子泵送效率差），導(dǎo)致ATP合成減少。這支持了ActR通過(guò)優(yōu)化ETC組成來(lái)維持能量穩(wěn)態(tài)的機(jī)制，從而增強(qiáng)耐受性。