Strong leaf surface basification and CO2 limitation of seagrass induced by epiphytic biofilm microenvironments

附生生物膜微環境導致的海草葉片表面強烈堿化和CO2限制

來源: Plant, Cell & Environment Volume 43,2020, Pages 174-187

《植物、細胞與環境》第43卷，2020年，第174-187頁

 

摘要

摘要闡述了沿海富營養化導致海草（Zostera marina L.）葉片附生生物膜過度生長的問題。本研究使用電化學微傳感器測量了有無附生生物膜覆蓋的海草葉片表面的O2、pH和CO2微梯度，以確定附生生物膜對葉片化學微環境的影響。結果表明，附生生物膜導致葉片表面pH、O2和無機碳濃度出現極端的晝夜波動，嚴重阻礙了植物的性能。在光照下，葉片附生生物膜及其擴散邊界層導致強烈的堿化，顯著降低了葉片表面的CO2和HCO3-可用性，從而導致碳限制和光呼吸增強，降低了光合效率。有附生生物膜時，葉片表面pH升高至>10，超過了主動光合作用的最終pH水平（~9.62）和CO2補償點。在黑暗中，附生生物膜導致葉片表面CO2增加和缺氧。由于強烈的葉圈堿化導致CO2耗盡以及代價高昂且有限的HCO3-利用，附生生物膜可導致海草嚴重的碳限制，增加了植物饑餓的風險。

 

研究目的

本研究旨在探究附生生物膜如何影響海草（大葉藻 Zostera marina L.）葉圈（phyllosphere）的關鍵物理化學條件和過程，特別是其對葉片微環境的pH、O2和無機碳（CO2, HCO3-）可用性的影響，以及由此引發的對海草光合作用和呼吸作用的生理生態效應。

 

研究思路

1.  從丹麥沿海采集帶有和不帶（作為空白對照）附生生物膜的大葉藻樣本。

2.  在實驗室定制的水流培養槽中，將海草葉片水平放置，并維持恒定的海水流速、溫度和鹽度。

3.  使用丹麥Unisense公司的微傳感器（O2、pH、CO2微傳感器）在受控光照條件（0, 30, 300 μmol photons·m-2·s-1）下，測量從主體水體到海草葉片表面的垂直微梯度剖面。

4.  根據測量的高分辨率pH和CO2濃度剖面，計算HCO3-的濃度剖面。

5.  根據濃度梯度，使用菲克第一擴散定律計算O2、CO2和HCO3-的通量。

6.  使用pH漂移實驗確定海草的最終pH和CO2補償點。

7.  對比分析有和無附生生物膜的葉片在所有測量參數上的差異，并建立擴散距離（附生生物膜+擴散邊界層厚度）與葉片表面化學條件的關系。

8.  綜合所有數據，解釋附生生物膜如何通過改變葉圈微環境來影響海草的碳獲取和光合性能。

 

測量的數據及研究意義

1.  氧氣（O2）濃度微梯度（圖2, 表1）：測量了從水體到葉片表面的O2濃度變化。研究意義：揭示了附生生物膜顯著增加了溶質總擴散距離（TDD），阻礙了氣體交換。在黑暗中減少了O2向葉片內部的擴散，影響海草內部組織通氣；在光照下導致葉片表面O2大量積累，可能促進光呼吸。

 

 

2.  酸堿度（pH）微梯度（圖2, 表1）：測量了從水體到葉片表面的pH變化。研究意義：直接證明了附生生物膜在光照下引起葉片表面強烈堿化（pH > 10），而在黑暗中引起酸化。這種pH變化是導致無機碳形態改變和可用性降低的直接原因。

3.  二氧化碳（CO2）濃度微梯度（圖2, 表1）：首次直接測量了海草葉片表面的CO2濃度動態。研究意義：顯示附生生物膜在光照下導致葉片表面CO2幾乎完全耗盡（~0 μM），低于海草的CO2補償點，造成嚴重的碳限制；在黑暗中則因呼吸作用導致CO2積累。

4.  碳酸氫根（HCO3-）濃度估算梯度（圖2, 表1）：基于測量的pH和CO2數據計算得出。研究意義：表明在光照下，附生生物膜覆蓋的葉片表面HCO3-濃度也顯著降低，但海草增加了對HCO3-的利用來彌補CO2的不足，不過這過程消耗更多能量。

5.  氣體通量（O2, CO2, HCO3-）（表1）：計算了通過葉片表面的凈氣體交換通量。研究意義：量化了附生生物膜導致的光合作用（O2產生、CO2吸收）和呼吸作用（O2消耗、CO2釋放）的速率變化，顯示光合效率顯著下降。

6.  最終pH和CO2補償點（表2）：通過pH漂移實驗測定。研究意義：確定了該種海草利用HCO3-的能力（最終pH > 9）和維持光合作用所需的最低CO2濃度（~0.6 μM），為解釋微傳感器數據提供了關鍵的生理閾值。

 

7.  葉片表面微環境動態范圍（圖4, 表3）：總結了有/無附生生物膜時葉片表面O2、pH、CO2、HCO3-濃度的晝夜變化范圍。研究意義：突出顯示了附生生物膜導致葉片微環境的化學條件出現極端波動，遠超無附生生物膜的葉片。

 

 

8.  擴散距離與化學參數的關系（圖5）：分析了總擴散距離（TDD）與葉片表面pH、CO2、HCO3-濃度的關系。研究意義：證明附生生物膜的厚度是驅動葉圈堿化和碳限制程度的主要因素，建立了生物物理結構與化學微環境之間的定量關系。

 

結論

1.  附生生物膜通過增加擴散邊界層和自身的厚度，顯著阻礙了海草葉片與周圍水體之間的物質交換。

2.  在光照下，附生生物膜和海草的光合作用共同導致葉片表面微環境發生強烈堿化（pH可達10以上），引起碳酸鹽體系 speciation 向CO32-轉變，致使葉片表面的CO2幾乎耗盡，HCO3-濃度也顯著降低，導致海草遭受嚴重的無機碳限制。

3.  海草雖然能利用HCO3-作為替代碳源，但效率低于CO2且能量成本更高。附生生物膜自身的光合作用還會與海草競爭無機碳。

4.  葉片表面的極端高pH和低CO2水平超過了海草的最終pH和CO2補償點，直接抑制了其光合作用效率。

5.  在黑暗中，附生生物膜及其呼吸作用導致葉片表面缺氧和CO2積累，減少了O2向葉片內部的擴散，損害了海草的夜間內部組織通氣。

6.  沿海富營養化引發的附生生物膜過度生長，通過造成海草碳限制和內部缺氧，嚴重威脅海草床的健康和生存。

 

使用丹麥Unisense電極測量數據的研究意義

使用丹麥Unisense公司生產的微傳感器（包括O2、pH和新型Clark型CO2微傳感器）進行測量，在本研究中具有至關重要的研究意義：

1.  高空間分辨率：這些微傳感器的尖端直徑極小（O2約10μm，pH約50μm，CO2約20-100μm），使其能夠精確測量葉片表面及其附生生物膜內極薄層（微米級）中的化學梯度。這是傳統宏觀采樣方法無法實現的，揭示了此前難以觀察到的微尺度物理化學過程。

2.  實時原位測量：微傳感器能夠在接近自然狀態的條件下（在流動海水中，受控光照下）對活體樣本進行原位實時測量，避免了固定、提取等操作對微環境造成的擾動，保證了數據的真實性和準確性。

3.  首次直接測量海草葉圈CO2：本研究采用的新型CO2微傳感器，提供了對海草葉片表面CO2濃度的首次直接測量數據（而非常見的估算值），這為了解海草光合作用的碳限制提供了最直接、可靠的證據，證實了CO2在附生生物膜覆蓋的葉片表面光照下幾乎耗盡的極端情況。

4.  量化通量和過程速率：通過測量得到的濃度梯度剖面，可以應用菲克擴散定律計算O2、CO2和HCO3-的實際通量，從而定量評估附生生物膜對海草光合作用和呼吸作用速率的影響，將微生物膜的結構特征（厚度）與植物的生理功能（氣體交換）直接聯系起來。

5.  揭示機制與驗證假說：高精度的微傳感器數據使得研究人員能夠明確區分和驗證不同機制的作用。例如，通過同時測量pH和CO2，清晰地揭示了是生物膜引起的堿化（pH升高）導致了CO2的化學消耗（ speciation 轉變），而非簡單的生物消耗，并證實了由此產生的碳限制是光合效率下降的關鍵原因。

總之，Unisense微傳感器的使用是本研究的核心技術支撐，其提供的高分辨率、原位、多參數同步測量數據，是揭示附生生物膜通過改變葉圈微環境物理化學條件進而影響海草生理生態這一核心機制的關鍵。