Semi-quantitative detection of hydrogen-associated or -free electron transfer within methanogenic biofilm of microbial electrosynthesis

微生物電合成產(chǎn)甲烷生物膜內(nèi)氫締合或無氫電子轉(zhuǎn)移的半定量檢測

來源：AEM Accepted Manuscript Posted Online 19 June 2020

 

摘要核心發(fā)現(xiàn)

 

本研究通過丹麥Unisense微電極實(shí)現(xiàn)了陰極生物膜內(nèi)氫濃度的原位檢測，揭示：

 

1.氫梯度分布：

 

陰極表面氫濃度最高（639.91 μmol/L），隨距離增加而衰減，在生物膜區(qū)（100 μm內(nèi)）銳減21%（圖1）；

 

2.雙路徑電子轉(zhuǎn)移：

 

氫關(guān)聯(lián)路徑貢獻(xiàn)甲烷生成的電子轉(zhuǎn)移比例為21.20%±1.57%（電位-0.4~-0.69 V），非氫路徑為主導(dǎo)（圖4）；

 

3.生物膜協(xié)同機(jī)制：

 

58.1 μm厚生物膜中細(xì)菌-古菌共定位（Pearson R=0.78），協(xié)同消耗氫（圖2）。

 

 

研究目的

 

1.解決爭議問題：

 

明確混合培養(yǎng)陰極生物膜中氫在電子轉(zhuǎn)移中的作用（直接 vs. 間接路徑）；

2.開發(fā)檢測方法：

 

建立微電極-CV聯(lián)用技術(shù)（MS-CV），實(shí)現(xiàn)生物膜內(nèi)氫動力學(xué)的半定量分析；

3.揭示產(chǎn)甲烷機(jī)制：

 

解析氫關(guān)聯(lián)路徑對微生物電合成系統(tǒng)（MES）甲烷生成的貢獻(xiàn)率。

 

研究思路

1. 反應(yīng)器構(gòu)建與生物膜培養(yǎng)

 

 

產(chǎn)甲烷MES反應(yīng)器：

 

單室設(shè)計(jì)（150 mL），陰極碳布負(fù)載Pt/C催化劑，陽極碳刷預(yù)處理（丙酮浸泡+450℃灼燒）；

 

生物膜培養(yǎng)：

 

接種廢水污泥+長期運(yùn)行反應(yīng)器出水，0.8 V恒壓運(yùn)行至甲烷產(chǎn)量穩(wěn)定（約30天）。

 

2. 多尺度檢測技術(shù)聯(lián)用

 

 

空間尺度：

 

Unisense氫微電極（H2-10型）掃描生物膜氫梯度（步進(jìn)精度μm級）；

 

時間尺度：

 

MS-CV技術(shù)（掃描速率2 mV/s）同步監(jiān)測電位-電流-氫濃度動態(tài)（圖3）；

 

 

生物結(jié)構(gòu)解析：

 

FISH成像確定生物膜厚度（58.1 μm）及微生物空間分布（圖2）。

 

3. 電子轉(zhuǎn)移路徑量化

 

 

氫貢獻(xiàn)率計(jì)算：

 

標(biāo)準(zhǔn)化氫濃度（μmol/L/mA）對比生物/非生物條件（圖4），結(jié)合電子平衡方程：

 

氫關(guān)聯(lián)電子比例=1?非生物條件標(biāo)準(zhǔn)化[H2]/生物條件標(biāo)準(zhǔn)化[H2]

 

 

電位依賴驗(yàn)證：

 

在-0.69 V、-0.54 V、-0.39 V下測定甲烷/氫產(chǎn)量，驗(yàn)證熱力學(xué)可行性。

 

關(guān)鍵數(shù)據(jù)及研究意義

1. 氫空間梯度（圖1）

 

數(shù)據(jù)：

 

陰極表面[H?]=639.91 μmol/L → 100 μm處降至514.13 μmol/L（衰減率19.6%）；

 

意義：

 

證實(shí)生物膜在微米尺度內(nèi)快速消耗氫，為氫關(guān)聯(lián)電子轉(zhuǎn)移提供直接證據(jù)；

 

機(jī)制：

 

100 μm內(nèi)衰減速率超擴(kuò)散模型預(yù)測，表明微生物活性驅(qū)動氫消耗。

 

2. 生物膜群落結(jié)構(gòu)（圖2）

 

數(shù)據(jù)：

 

FISH顯示古菌（紅色）與細(xì)菌（綠色）共定位（Pearson R=0.78），Methanobacteriaceae占比87.12%；

 

意義：

 

揭示氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌主導(dǎo)氫消耗，發(fā)酵菌（6.43%）提供次級代謝支持；

 

機(jī)制：

 

多營養(yǎng)級協(xié)作（發(fā)酵-產(chǎn)甲烷菌模型）提升甲烷產(chǎn)率。

 

3. MS-CV動態(tài)響應(yīng)（圖3）

 

數(shù)據(jù)：

 

生物條件下析氫起始電位負(fù)移（-0.30 V vs. 非生物-0.15 V），過電位增加；

 

意義：

 

生物膜抑制析氫反應(yīng)，促進(jìn)電子向非氫路徑分流；

 

機(jī)制：

 

微生物即時消耗氫降低局部[H?]，推動反應(yīng)平衡向析氫方向移動。

 

4. 氫貢獻(xiàn)率量化（圖4）

 

數(shù)據(jù)：

 

標(biāo)準(zhǔn)化[H?]：生物條件（2.42~17.97 μmol/L/mA） vs. 非生物（9.83~71.61 μmol/L/mA）；

 

意義：

 

計(jì)算得出氫關(guān)聯(lián)電子轉(zhuǎn)移貢獻(xiàn)率21.20%±1.57%（電位-0.4~-0.69 V）；

 

機(jī)制：

 

低電位區(qū)（<-0.4 V）氫關(guān)聯(lián)路徑激活，高電位區(qū)以直接電子轉(zhuǎn)移為主。

 

丹麥Unisense電極的核心貢獻(xiàn)

技術(shù)突破

 

 

原位微尺度監(jiān)測：

 

10 μm尖端分辨率（文獻(xiàn)H2-10型）實(shí)現(xiàn)58.1 μm生物膜內(nèi)氫梯度測繪（圖1）；

 

動態(tài)過程解析：

 

2秒采樣間隔捕捉CV掃描中氫濃度瞬態(tài)變化（圖3），揭示電位依賴的析氫-消耗平衡；

 

生物/非生物對比：

 

標(biāo)準(zhǔn)化氫濃度量化微生物代謝對氫消耗的貢獻(xiàn)（圖4）。

 

關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)

 

1.氫消耗熱點(diǎn)定位：

 

生物膜前100 μm消耗約20%氫，對應(yīng)產(chǎn)甲烷菌富集區(qū)（圖1+圖2）；

2.電子轉(zhuǎn)移路徑驗(yàn)證：

 

氫關(guān)聯(lián)路徑貢獻(xiàn)率約21%，修正了“氫為唯一載體”的傳統(tǒng)認(rèn)知；

3.代謝動力學(xué)參數(shù)：

 

析氫過電位增加150 mV，為生物電化學(xué)系統(tǒng)優(yōu)化提供關(guān)鍵參數(shù)。

 

不可替代性

 

 

傳統(tǒng)方法局限：

 

氣相色譜僅提供體相[H?]，無法解析生物膜微環(huán)境；

 

Unisense優(yōu)勢：

 

微米級空間分辨率與秒級時間分辨率聯(lián)用，首次揭示生物膜內(nèi)氫周轉(zhuǎn)動力學(xué)。

 

結(jié)論

 

1.雙路徑電子轉(zhuǎn)移：

 

混合培養(yǎng)陰極生物膜中，氫關(guān)聯(lián)路徑貢獻(xiàn)約21%電子轉(zhuǎn)移，非氫路徑（可能為直接電子轉(zhuǎn)移）占主導(dǎo)；

2.電位調(diào)控策略：

 

-0.4 V以下電位激活氫關(guān)聯(lián)路徑，優(yōu)化電位可提升甲烷電子效率至0.69 mol CH?/mol e?（0.6 V時）；

3.生物膜工程啟示：

 

強(qiáng)化古菌-細(xì)菌共定位可提升氫周轉(zhuǎn)速率，降低系統(tǒng)過電位。

 

Unisense技術(shù)價(jià)值：其原位微尺度氫監(jiān)測能力為生物電化學(xué)系統(tǒng)提供了不可替代的機(jī)制研究工具，推動從“黑箱模型”向“過程解析”的范式轉(zhuǎn)變。

 

圖示關(guān)聯(lián)：

 

圖1：Unisense微電極測量的氫空間梯度

 

圖2：FISH成像的生物膜結(jié)構(gòu)（古菌-細(xì)菌共定位）

 

圖3：MS-CV聯(lián)用的氫動態(tài)響應(yīng)

 

圖4：標(biāo)準(zhǔn)化氫濃度與電子轉(zhuǎn)移貢獻(xiàn)率計(jì)算